引言 走过风霜雨雪，走过春夏秋冬，走过流年岁月，又走到了岁尾年终！还有不到5天就是鼠年了，给所有支持欧易生物的你们献上本篇：精雕细琢-宏基因组ARGs分析。预祝各位鼠年大吉！     文章内容概览 一、环境中抗生素抗性基因（ARGs）检测方式 二、宏基因组测序中常见抗性基因注释数据库及方法 三、欧易生物宏基因组之-抗性基因挖掘分析   抗生素的出现，一定程度上解决了医疗和农业方面的很多问题，但随着抗生素及其抗菌产品的广泛应用，自然和人工环境中的抗生素残留也同时带来了一定的危害。   现有研究表明，抗生素及其抗性基因（Antibiotic resistance genes, ARGs）的污染已经遍布水、土壤、大气等介质。抗生素的滥用使90%以上不能被动物和人体吸收的部分，经过羟基化、裂解等代谢反应，最终以原药形态直接排放于环境中，形成广泛且难以控制的污染[1]。长期的低浓度抗生素的存在会对水体中的微生物群落产生影响，并通过食物链的传递作用影响高级生物，破坏生态系统平衡[2]。 图A 图B ARGs是一种新型、持久性的环境污染物，细菌中携带ARGs的质粒、整合子以及转座子等可在同种属菌株间和不同种属的菌株间发生水平基因转移（Horizontal genetransfer，HGT），即使抗性菌株死亡后，携带ARGs的裸露 DNA会在脱氧核苷酸酶的保护作用下长期存在[5]。 2016年一篇综述（上图A），讨论了环境中抗菌素耐药性（Antimicrobial Resistance，AMR）及所涉及的环境监管[3]。同年另一篇（上图B）讨论了关于抗菌素耐药性，及全球如何应对耐药性感染[4]。抗生素耐药性的过快增长，已经引起世界范围的高度重视。对环境中的抗性基因的检测及机制研究，已经成为科研工作者的重要课题之一。     一、环境中抗生素抗性基因（ARGs）检测方式   使用特定抗生素的选择性培养基，根据表型分离耐药细菌； PCR/测序研究ARGs基因型； qPCR以相对/绝对的方式定量ARGs； 利用可用的引物/探针，进行高通量qPCR和ARGs芯片检测； 宏基因组测序技术，对已知和未知ARGs的种类、组成、丰度、功能等进行检测。   对于抗性基因的大规模检测，宏基因组测序是较为常见的技术，可同时获取环境中抗性基因的分布及其序列，从而可进一步挖掘其功能及机制。     二、宏基因组测序中常见抗性基因注释数据库及方法   （1）ARDB（Antibiotic Resistance Genes Database）数据库 ARDB数据库为马里兰大学帕克学院所建立，但少有更新（最近一次更新于2009年7月份），而抗性基因并不是一成不变的，随着菌株的不断进化，以及新的抗生素的生产和使用，新的耐药基因也陆续产生。 （2）CARD（Comprehensive Antibiotic Resistance Database）数据库 CARD数据库在构建之初就充分考虑到新的耐药基因随抗生素的使用不断产生的问题，搭建了一个基于志愿者贡献的数据共享平台，以ARO（Antibiotic Resistance Ontology）为核心对抗性数据进行整合，以达到数据实时更新的目的。 （3）DeepARG算法 弗吉尼亚理工大学计算机科学系Liqing Zhang开发了一款机器学习的方法来预测宏基因组数据中ARGs的工具：DeepARG。该数据库收集了CARD、ARDB和UNIPROT数据库信息，从UNIPROT中搜集的方法是选择含有“Antibiotic Resistance”关键词的序列。   利用监督学习模型，将UNIPROT数据集的基因划分为训练和验证数据集，并将其与已知抗性基因组数据库ARDB和CARD比对的相似值作为特征值。DeepARG包含两个模型：DeepARG-LS（长基因序列模型，比如组装好的contigs）和DeepARG-SS（短序列模型，如原始测序的reads）。[6]     （4）整合数据库及分析平台ARGs-OAP 香港大学张彤教授研究团队开发了整合ARDB和CARD的数据库和分析方法：ARGs-OAP。[7] ARGs-OAP v1.0主要整合CARD以及ARDB数据的抗性基因组数据，而ARGs-OAP v2.0则在v1.0的基础上新纳入了NCBI-NR数据库中的ARG序列。ARGs-OAP v2.0在v1.0版本基础上，序列增加了两倍，数据证明从各种环境样品中检测宏基因组中ARGs的覆盖率有所提高。 ARGs-OAP v2.0对ARGs进行注释及分类的流程如下：   ARGs-OAP v2.0使用SARGfam数据库，SARGfam数据库基于隐马尔可夫模型（HMM）来鉴定组装序列，对ARGs基因进行定性定量，及subtype分类。 ARGs-OAP v2.0的另一项优势在于，它对于基于细胞数目标准化ARGs的方法进行了优化，提供了3种对于ARGs基因进行丰度标准化的方法： 1）基于reads标准化，标准化单位为ppm 在高通量测序中，不同样本测序所获得的总reads数目不同，在对不同样本进行比较前，通常会进行标准化。ppm（part per million, one ARGs-like sequence per million sequences）[8]即每百万的sequence中ARGs-like sequence的数目。 2）基于16S 拷贝数标准化 不同物种的16S拷贝数不同，基于16S拷贝数标准化（copies of ARG per copy of 16S rRNA）[9]的方法如下： NARG-like sequences：注释上的ARG的序列数； Lreads：序列长度； LARG reference sequences：参考ARG序列长度； n：比对上参考序列的ARG序列； N16S sequences：16S rRNA基因序列数； L16S sequences：16S rRNA基因全长 3）基于宏基因组数据集细胞数目标准化 同时，可以通过基本的单拷贝marker基因的平均覆盖率，来改进细胞数量的量化标准。       m：宏基因组数据集中，根据提取的16S信息检测到的总物种类群数； ai：宏基因组数据集中分类群i的丰度； A：所有m个分类群的总丰度； Mi：CopyRighter数据库中分类群i的拷贝数； 通过比较ARGs-OAP v1.0和ARGs-OAP v2.0的抗性基因注释结果发现，在不同环境样品中，v2.0版本数据库可以获得更高的ARGs丰度。 河水、沉积物、饮用水样本比较结果显示，ARGs检测率提高了10.8%~35.8%；污水处理厂的样本（ADS、AS&BF、污水排放口）比较结果显示，ARGs检测率提高了3.6~8.5%；污水处理厂进水口提高了3.3%；畜牧粪便提高了1.8%；     三、欧易生物宏基因组之-抗性基因挖掘分析   ARGs-OAP v2.0整合了CARD、ARDB以及NCBI NR库抗生素抗性基因数据，可以获得更完整全面的抗性基因数据。并且提供3种可供选择的标准化方法。这对于重点研究抗性基因的老师们来说，无疑是一款利器。 欧易生物拥有业内领先的微生物组学分析团队，可为广大科研工作者提供基于抗性基因分析的数据服务，分析流程如下： 具体分析内容展示，我们来一睹为快： 图1 | 抗性基因分布柱状图   图2 | 抗性基因分布circos图   通过对抗性基因种类进行分类后，分别用柱状图、circos圈图来展示各样本中抗性基因分类及丰度。   图3（1）| 抗性基因二维PCoA图   图3（2）| 抗性基因三维PCoA图   根据各个样本中抗性基因丰度，通过二维以及三维PCoA展示样本间/分组间差异。   图4 | 抗性基因组Adonis/PERMANOVA分析   进一步通过统计检验，来判别不同分组间抗性基因分布差异显著性，上图中p值为0.01，表明Case和OE两组间抗性基因分布差异显著。   图5 | 抗性基因组LEfSe分析   上图通过LEfSe分析，找到OE组和Case组间差异的抗性基因biomarker。   图6 |  差异抗性基因Boxplot图   对于差异的抗性基因，通过Boxplot图来展示其在两组间的丰度分布。   抗性基因研究之路，路漫漫其修远，欧易生物愿为各位老师提供助力！如果有相关研究需求，欢迎联系我们咨询~等着您哦~   参考文献 [1] 周启星, 罗义, 王美娥. 抗生素的环境残留、生态毒性及抗性基因污染[J]. 生态毒理学报, 2007, 2 (3): 243-249. [2] 王路光, 朱晓磊, 王靖飞, 田在锋. 环境水体中的残留抗生素及其潜在风险[J]. 工业水处理, 2009, 29 (5): 11-14. [3] Singer AC, Shaw H, Rhodes V, et al. Review of antimicrobial resistance in the environment and its relevance to environmental regulators. Frontiers in microbiology, 2016, 7:1728. [4] O’Neill, J., et al. Review on antimicrobial resistance, tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. London: Wellcome Trust and UK Government (2016). [5] 沈怡雯, 黄智婷, 谢冰. 抗生素及其抗性基因在环境中的污染、降解和去除研究进展[J]. 应用与环境生物学报, 2015(02):3-9. [6] Arango-Argoty G , Garner E , Pruden A , et al. DeepARG: a deep learning approach for predicting antibiotic resistance genes from metagenomic data[J]. Microbiome, 2018, 6(1):23. [7] Yin X, Jiang XT, Chai B, et al. ARGs-OAP v2.0 with an Expanded SARG Database and Hidden Markov Models for Enhancement Characterization and Quantification of Antibiotic Resistance Genes in Environmental Metagenomes. Bioinformatics, 2018, 34(13):2263-70. [8] Yang Y, Li B, Ju F, et al. Exploring variation of antibiotic resistance genes in activated sludge over a four-year period through a metagenomic approach. Environmental science & technology, 2013: 10197-10205. [9] Li B, Yang Y, Ma LP, et al. Metagenomic and network analysis reveal wide distribution and co-occurrence of environmental antibiotic resistance genes. ISME, 2015, 9(11): 2490-502.   如果您想了解更多关于微生物组研究的知识和前沿进展，可以申请加入欧易-微生物测序交流 QQ 群（ 群号：武9866234七）， 群内会推荐微生物组研究领域最新文献，举办微生物组研究系列讲座。   我们在这里等你哟， 一起看文献， 学知识， 做科研！      # END #    本文系欧易生物原创  转载请注明本文转自欧易生物